A Yorki Egyetem biokémikusai nemzetközi együttműködőkkel közösen feltárták azt az enzimatikus útvonalat, amelyet a dohánynövények a nikotin egyszerű kémiai építőelemekből történő előállítására használnak. A felfedezés egy olyan biológiai rejtélyt old meg, amely azóta fennállt, hogy a vegyészek 1828-ban először vontak ki nikotint a dohánylevelekből.
Az eredmények tisztázzák a függőséget okozó alkaloid előállításáért felelős genetikai és biokémiai mechanizmusokat. A mezőgazdasági dohánytermesztésre gyakorolt hatásán túl a kutatás molekuláris eszközöket kínál a nikotin eltávolítására azokból a dohányfajokból, amelyeket gyógyszerek, vakcinák és diagnosztikai fehérjék előállítására szolgáló platformként használnak.
„Nagy pillanat ez a növénytudomány és a biokémia számára, hiszen most választ kaptunk arra a kérdésre, amelyet több mint 200 éve kutatunk!” – mondta Dr. Benjamin Lichman, a Yorki Egyetem Új Mezőgazdasági Termékek Központjának munkatársa.
A nikotin bioszintézisének két évszázados kutatása
A nikotin a természetben elsősorban alkaloid alapú védekezési mechanizmusként működik. A dohánynövények a gyökereikben állítják elő a vegyületet, majd a levelekbe szállítják, hogy elriasszák a növényevő rovarokat és legelő állatokat. Emberi fogyasztás esetén a molekula közvetlenül az idegrendszer nikotinos acetilkolinreceptoraihoz kötődik, stimulánsként hat, és fizikai függőséget okoz.
A kutatók évtizedek óta ismerték a nikotin képződéséhez szükséges alapvető kémiai prekurzorokat. Szerkezeti vizsgálatok megerősítették, hogy a molekula két különálló heterociklusos gyűrűből áll, amelyeket egyetlen szén-szén kötés kapcsol össze:
- Piridingyűrű: Nikotinsavból (a B3-vitamin egyik formájából) származik.
- Pirrolidingyűrű: Az aminosavból származó N-metil-pirrolínium kationból képződik.
Az alapanyagok ismerete ellenére a tudósok nem tudták azonosítani azt a katalitikus mechanizmust, amely a két gyűrű összekapcsolásáért felel. E molekulák közvetlen kondenzációjának laboratóriumi megfigyelésére tett kísérletek ismételten megrekedtek, mivel a nikotinsav standard biológiai körülmények között kémiailag stabil marad. Aktiválási lépés nélkül a gyűrűk összekapcsolásához szükséges energiagát túl magas volt ahhoz, hogy az ismert növényi enzimek leküzdhessék.
A mechanizmus: rejtett aktiváló glükoziláció
A Yorki Egyetem csapata felfedezte, hogy a dohánynövény egy váratlan köztes termék, a glükóz alkalmazásával kerüli meg ezt a kémiai akadályt. A növény átmenetileg egy glükózcukor-molekulát kapcsol a nikotinsavhoz, destabilizálva a vegyületet és csökkentve a későbbi enzimreakciókhoz szükséges aktiválási energiát.
Ez a rejtett aktiváló glükozilációnak nevezett biológiai stratégia ideiglenes molekuláris fogantyúként működik. Miután a glükóz aktiválja a prekurzort, más enzimek a gyűrűt az N-metil-pirrolíniumhoz kapcsolják. Amint a szerkezeti kötés kialakul, egy másik enzim lehasítja a cukrot a komplexről, és kész nikotinmolekulát hagy maga után.
Mivel a glükózmolekula még azelőtt leválik, hogy a végtermék elhagyná az enzimkomplexet, nem hagy kémiai nyomot a kész alkaloidban. Ez az átmeneti jelleg magyarázza, miért nem sikerült analitikai vegyészek generációinak elkülöníteniük az útvonal köztes szakaszait.
„A dohánynövények nikotintermelésének rejtélye az 1820-as évek vége óta fennáll, amikor a nikotint először kivonták a növényekből” – mondta Lichman. „Ezzel az új tudással eltávolíthatjuk vagy új célra használhatjuk a növény által természetes módon termelt nikotint, jobb biotechnológiai eszközöket hozhatunk létre, és izgalmas lehetőséget kínál a jövőben arra is, hogy a dohány nikotinképző rendszerét hasznos gyógyszerészeti vegyületek előállítására alakítsuk át.”
A négyenzimes kaszkád
A reakciósorozat igazolására a kutatócsoport négy különálló enzimet izolált és tisztított dohányszövetekből, majd az élő sejten kívül rekonstruálta a teljes metabolikus útvonalat.
| Enzim | Biokémiai funkció | Szerepe az útvonalban |
|---|---|---|
| NaGT | Glükoziltranszferáz | Glükózt kapcsol a nikotinsavhoz egy aktivált köztes termék létrehozásához. |
| NaGR | Reduktáz | Hidrogénatomokat ad át az aktivált prekurzormolekula redukálásához. |
| NicGS | Kapcsoló szintáz | Biztosítja a sztereokémiai szabályozást, biológiailag aktív (S)-nikotint termelve. |
| NicGH | Glükozidáz / hidroláz | Hidrolizálja és eltávolítja az ideiglenes glükózcímkét, tiszta nikotint eredményezve. |
Nagy felbontású röntgenkrisztallográfiával az első szerző, Benjamin Schwabe atomi felbontásban meghatározta a NaGR és a NicGS háromdimenziós szerkezetét. A szerkezeti modellek kimutatták, hogy a NicGS fizikailag orientálja a reakcióköztes termékeket a kötőzsebében, hogy meghatározza a végső kötés térbeli konfigurációját.
Ez a szerkezeti szabályozás biológiailag meghatározó. A biológiai molekulák gyakran királis enantiomerekként léteznek – ugyanazon kémiai képlet tükörképi változataiként. A dohánynövények szinte kizárólag (S)-nikotint termelnek, azt az optikai izomert, amely hatékonyan kötődik az emlősök idegrendszeri receptoraihoz. Amikor a kutatók NicGS nélkül vizsgálták az útvonalat, a rendszer a bal- és jobbkezes izomerek szabályozatlan racém elegyét állította elő, bizonyítva, hogy a NicGS határozza meg a természetes dohány sztereokémiai pontosságát.
Ellenőrzés élő növényi rendszerekben
A sejtmentes laboratóriumi szintézist követően a kutatók élő növényi szövetben is igazolták az enzimatikus útvonalat. A négy enzimet kódoló géneket bejuttatták a Nicotiana benthamiana növénybe, egy vad ausztrál dohányrokonba, amelyet széles körben alkalmaznak mezőgazdasági és gyógyszerészeti kutatásokban.
A génmódosított növények jelölt nikotinmolekulákat termeltek, amelyek megegyeztek a természetes növényi profilokkal. Továbbá a kaszkád egyes génjeinek kiiktatásával a kutatók minden lépést igazoltak:
- A NicGH elnyomása stabil, glükózhoz kötött nikotinprekurzorok felhalmozódását okozta a növényekben, szabad nikotin termelése nélkül.
- A NicGS elhagyása megzavarta az útvonal sztereospecifitását, igazolva annak szabályozó szerepét élő sejtkörnyezetben.
A dohányplatformok fejlesztése molekuláris gazdálkodáshoz
E négy enzim azonosítása közvetlen jelentőséggel bír a modern biogyártás számára. Bár a kereskedelmi dohány továbbra is a cigarettával azonosítható, a növénybiológusok gyakran használnak dohányfajokat molekuláris gazdálkodáshoz – gyorsan növekvő növényi szöveteket alkalmazva bioreaktorként gyógyászati fehérjék, monoklonális antitestek és vakcinaantigének szintézisére.
A Nicotiana benthamiana kedvelt növény a molekuláris gazdálkodásban, mert heteken belül nagy mennyiségű biomasszát ad, és könnyen befogadja az átmeneti expressziós vektorokat. A természetes nikotintermelés azonban tartós gyártási akadályt jelent. Az alkaloid gyógyszerészeti koncentrációban mérgező az emberre, és együtt tisztul a célfehérjékkel, ezért költséges, többlépcsős szűrési folyamatokra van szükség a terápiás molekulák elkülönítéséhez.
„A dohánynövények biotechnológiai platformként használhatók vakcinák vagy más gyógyszerészeti termékek előállítására, de ezt megnehezíti a nikotin jelenléte, amely szennyezi a termékeket, és feldolgozást igényel az eltávolítása” – magyarázta Lichman.
A NaGT-t vagy NicGS-t kódoló gének célzott génszerkesztő eszközökkel, például CRISPR-rel történő deaktiválásával a mezőgazdasági kutatók nikotinmentes dohányvonalakat nemesíthetnek. Ezek a növények megőrzik gyors vegetatív növekedésüket és fehérjeszintetizáló kapacitásukat, miközben teljesen kiküszöbölik az alkaloidszennyezést, csökkentve a növényi eredetű terápiás készítmények gyártási költségeit.
Új gyógyszerészeti alkaloidok tervezése
A felfedezés enzimatikus keretrendszert is teremt nem addiktív gyógyászati vegyületek szintéziséhez. A négyenzimes rendszer moduláris jellege lehetővé teszi a kutatók számára, hogy alternatív prekurzormolekulákat juttassanak a kaszkádba.
Koncepcióigazoló kísérletekben a kutatócsoport bemutatta, hogy prekurzoranalógok helyettesítésével az enzimek rokon alkaloidokat, köztük nornikotint és anabazint képesek előállítani. Mivel számos növényi eredetű alkaloid a központi idegrendszerre ható gyógyszerek, fájdalomterápiák és rovarirtó szerek szerkezeti alapját képezi, e enzimatikus mechanizmus adaptálása tiszta módszert kínál összetett kémiai vegyületek előállítására magas hőmérsékletű ipari szintézis nélkül.
„Új lehetőségeket nyit meg a dohánynövények jó célokra való felhasználására: nem cigarettákhoz, hanem gyógyszerekhez és más értékes termékekhez” – mondta Lichman.
- A kutatási eredmények online elérhetők a Nature Communications folyóiratban.
