Biochemici van de Universiteit van York hebben, samen met internationale samenwerkingspartners, het enzymatische traject voltooid dat tabaksplanten gebruiken om nicotine op te bouwen uit eenvoudige chemische bouwstenen. De ontdekking lost een biologisch raadsel op dat al bestaat sinds scheikundigen in 1828 voor het eerst nicotine uit tabaksbladeren isoleerden.
De bevindingen verduidelijken de genetische en biochemische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de productie van deze verslavende alkaloïde. Naast de implicaties voor de landbouwkundige teelt van tabak biedt het onderzoek moleculaire hulpmiddelen om nicotine te verwijderen uit tabakssoorten die worden gebruikt als productieplatforms voor farmaceutica, vaccins en diagnostische eiwitten.
“Het is een belangrijk moment in de plantenwetenschap en biochemie dat we nu het antwoord hebben waar we meer dan 200 jaar naar hebben gezocht!” zei dr. Benjamin Lichman van het Centre for Novel Agricultural Products van de Universiteit van York.
De zoektocht van twee eeuwen naar nicotinebiosynthese
Nicotine fungeert in het wild voornamelijk als een verdedigingsmechanisme in de vorm van een alkaloïde. Tabaksplanten produceren de verbinding in hun wortels en transporteren deze naar hun bladeren om plantenetende insecten en grazende dieren af te schrikken. Wanneer nicotine door mensen wordt geconsumeerd, bindt het molecuul zich rechtstreeks aan nicotinerge acetylcholinereceptoren in het zenuwstelsel, waar het als stimulerend middel werkt en lichamelijke afhankelijkheid veroorzaakt.
Decennialang begrepen onderzoekers de basische chemische voorlopers die nodig zijn voor de vorming van nicotine. Structurele analyses bevestigden dat het molecuul bestaat uit twee afzonderlijke heterocyclische ringen die door één koolstof-koolstofbinding met elkaar verbonden zijn:
- Een pyridinering: Afgeleid van nicotinezuur (een vorm van vitamine B3).
- Een pyrrolidinering: Gevormd uit het van aminozuren afgeleide kation N-methylpyrrolinium.
Ondanks hun kennis van de uitgangsmaterialen konden wetenschappers de katalytische machinerie die verantwoordelijk is voor het verbinden van de twee ringen niet identificeren. Pogingen om de directe condensatie van deze moleculen in laboratoriumomgevingen waar te nemen, liepen herhaaldelijk vast omdat nicotinezuur onder standaard biologische omstandigheden chemisch stabiel blijft. Zonder een activeringsstap bleef de energiebarrière voor het binden van de ringen te hoog voor bekende plantenenzymen.
Het mechanisme: verborgen activerende glucosylering
Het team van de Universiteit van York ontdekte dat de tabaksplant deze chemische barrière omzeilt door een onverwacht tussenproduct te gebruiken: glucose. De plant bindt tijdelijk een glucose-suikermolecuul aan nicotinezuur, waardoor de verbinding wordt gedestabiliseerd en de activeringsenergie voor daaropvolgende enzymatische reacties daalt.
Deze biologische strategie, aangeduid als verborgen activerende glucosylering, werkt als een tijdelijk moleculair handvat. Zodra de glucose de voorloper activeert, koppelen andere enzymen de ring aan N-methylpyrrolinium. Zodra de structurele binding is gevormd, splitst een ander enzym de suiker van het complex af, waardoor een voltooid nicotinemolecuul overblijft.
Omdat het glucosemolecuul loslaat voordat het eindproduct het enzymatische cluster verlaat, liet het geen chemisch spoor na in de uiteindelijke alkaloïde. Dit tijdelijke karakter verklaart waarom generaties analytisch chemici de tussenstadia van het traject niet konden isoleren.
“Het raadsel hoe tabaksplanten nicotine produceren bestaat al sinds het einde van de jaren 1820, toen nicotine voor het eerst uit de planten werd geëxtraheerd,” zei Lichman. “Met deze nieuwe kennis kunnen we de nicotine die de plant van nature produceert verwijderen of herbestemmen en betere biotechnologische hulpmiddelen creëren. Er is ook spannend toekomstig potentieel om het nicotinevormende systeem van tabak aan te passen voor de productie van nuttige farmaceutische verbindingen.”
De cascade van vier enzymen
Om de reactieserie te verifiëren, isoleerde en zuiverde het onderzoeksteam vier afzonderlijke enzymen uit tabaksweefsel, waarmee het volledige metabolische traject buiten de levende cel werd gereconstrueerd.
| Enzym | Biochemische functie | Rol in het traject |
|---|---|---|
| NaGT | Glucosyltransferase | Hecht glucose aan nicotinezuur om een geactiveerd tussenproduct te creëren. |
| NaGR | Reductase | Draagt waterstofatomen over om het geactiveerde voorlopermolecuul te reduceren. |
| NicGS | Koppelingssynthase | Zorgt voor stereochemische controle en produceert biologisch actieve (S)-nicotine. |
| NicGH | Glucosidase / hydrolase | Hydrolyseert en verwijdert de tijdelijke glucosemarker, wat pure nicotine oplevert. |
Met behulp van röntgenkristallografie met hoge resolutie bepaalde eerste auteur Benjamin Schwabe de driedimensionale structuren van NaGR en NicGS op atomaire resolutie. De structurele modellen toonden aan dat NicGS de reactietussenproducten fysiek oriënteert binnen zijn bindingsplaats om de ruimtelijke configuratie van de uiteindelijke binding te sturen.
Deze structurele controle is biologisch doorslaggevend. Biologische moleculen bestaan vaak als chirale enantiomeren: spiegelbeeldversies van dezelfde chemische formule. Tabaksplanten produceren vrijwel uitsluitend (S)-nicotine, het optische isomeer dat zich effectief bindt aan neurologische receptoren van zoogdieren. Toen de onderzoekers het traject zonder NicGS testten, produceerde het systeem een ongecontroleerd racemisch mengsel van zowel links- als rechtshandige isomeren, wat bewijst dat NicGS de stereochemische precisie van natuurlijke tabak bepaalt.
Verificatie in levende plantsystemen
Na de celvrije laboratoriumsynthese valideerden de onderzoekers het enzymatische traject in levend plantenweefsel. Zij brachten de genen die voor de vier enzymen coderen in bij Nicotiana benthamiana, een wilde Australische verwant van tabak die veel wordt gebruikt in landbouwkundig en farmaceutisch onderzoek.
De gemodificeerde planten produceerden gelabelde nicotinemoleculen die overeenkwamen met natuurlijke plantenprofielen. Bovendien verifieerden de onderzoekers elke stap door afzonderlijke genen binnen de cascade uit te schakelen:
- Onderdrukking van NicGH zorgde ervoor dat de planten stabiele, aan glucose gebonden nicotinevoorlopers ophoopten zonder vrije nicotine te produceren.
- Het weglaten van NicGS verstoorde de stereospecificiteit van het traject, waarmee de regulerende rol ervan in levende cellulaire omgevingen werd bevestigd.
Verbetering van tabaksplatforms voor moleculaire landbouw
De identificatie van deze vier enzymen heeft directe toepassingen voor moderne bioproductie. Hoewel commerciële tabak synoniem blijft met sigaretten, gebruiken plantenbiologen tabakssoorten vaak voor moleculaire landbouw: het inzetten van snelgroeiende plantenweefsels als bioreactoren om medische eiwitten, monoklonale antilichamen en vaccinantigenen te synthetiseren.
Nicotiana benthamiana wordt in moleculaire landbouw gewaardeerd omdat de plant binnen enkele weken grote hoeveelheden biomassa oplevert en eenvoudig tijdelijke expressievectoren accepteert. De natuurlijke nicotineproductie vormt echter een blijvende uitdaging voor de productie. De alkaloïde is bij farmaceutische concentraties toxisch voor mensen en zuivert samen met doeleiwitten op, waardoor kostbare filtratieprocessen in meerdere stappen nodig zijn om therapeutische moleculen te isoleren.
“Tabaksplanten kunnen in de biotechnologie worden gebruikt als platforms voor de productie van vaccins of andere farmaceutische producten, maar de aanwezigheid van nicotine zorgt voor problemen omdat deze de producten verontreinigt en moet worden verwijderd door verdere verwerking,” legde Lichman uit.
Door gerichte genbewerkingsinstrumenten zoals CRISPR te gebruiken om de genen die voor NaGT of NicGS coderen te deactiveren, kunnen landbouwkundigen nicotinevrije tabakslijnen kweken. Deze planten behouden hun snelle vegetatieve groei en capaciteit voor eiwitsynthese, terwijl alkaloïdeverontreiniging volledig wordt uitgesloten, waardoor de productiekosten van plantaardig afgeleide therapeutica dalen.
Ontwikkeling van nieuwe farmaceutische alkaloïden
De ontdekking legt ook een enzymatisch kader vast voor de synthese van niet-verslavende geneeskrachtige verbindingen. Door het modulaire karakter van het systeem met vier enzymen kunnen onderzoekers alternatieve voorlopermoleculen in de cascade invoeren.
In proof-of-conceptproeven toonde het onderzoeksteam aan dat vervanging door analoge voorlopers de enzymen in staat stelde verwante alkaloïden te produceren, waaronder nornicotine en anabasine. Omdat veel plantaardig afgeleide alkaloïden dienen als structurele basis voor geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel, pijntherapieën en insecticiden, biedt aanpassing van dit enzymatische mechanisme een schone methode om complexe chemische verbindingen te produceren zonder industriële synthese bij hoge temperaturen.
“Het opent nieuwe manieren om tabaksplanten voor het goede te gebruiken: niet in sigaretten, maar voor geneesmiddelen en andere waardevolle producten,” zei Lichman.
- De onderzoeksbevindingen zijn online beschikbaar in het tijdschrift Nature Communications.
