Біохіміки Йоркського університету у співпраці з міжнародними колегами завершили картування ферментативного шляху, який тютюнові рослини використовують для синтезу нікотину з простих хімічних будівельних блоків. Це відкриття розв’язує біологічну загадку, що існувала з часів першого виділення нікотину хіміками з тютюнового листя у 1828 році.
Результати дослідження пояснюють генетичні та біохімічні механізми, відповідальні за виробництво алкалоїду, що викликає залежність. Окрім наслідків для сільськогосподарського вирощування тютюну, дослідження надає молекулярні інструменти для видалення нікотину з видів тютюну, що використовуються як платформи для виробництва фармацевтичних препаратів, вакцин і діагностичних білків.
«Це важливий момент для науки про рослини та біохімії, адже тепер ми маємо відповідь, за якою полювали понад 200 років!» — сказав доктор Бенджамін Ліхман із Центру новітніх сільськогосподарських продуктів Йоркського університету.
Двовікові пошуки біосинтезу нікотину
У дикій природі нікотин насамперед виконує функцію алкалоїдного захисного механізму. Тютюнові рослини виробляють цю сполуку в коренях і транспортують її до листя, щоб відлякувати комах-фітофагів і травоїдних тварин. При споживанні людиною молекула безпосередньо зв’язується з нікотиновими ацетилхоліновими рецепторами нервової системи, діючи як стимулятор і спричиняючи фізичну залежність.
Протягом десятиліть дослідники розуміли основні хімічні прекурсори, необхідні для утворення нікотину. Структурні дослідження підтвердили, що молекула складається з двох різних гетероциклічних кілець, з’єднаних одним вуглець-вуглецевим зв’язком:
- Піридинове кільце: Походить із нікотинової кислоти (форми вітаміну B3).
- Піролідинове кільце: Утворюється з катіона N-метилпіролінію, похідного амінокислоти.
Попри знання вихідних матеріалів, науковці не могли ідентифікувати каталітичний механізм, відповідальний за з’єднання двох кілець. Спроби спостерігати пряму конденсацію цих молекул у лабораторних умовах неодноразово припинялися, оскільки нікотинова кислота залишається хімічно стабільною за стандартних біологічних умов. Без етапу активації енергетичний бар’єр для зв’язування кілець залишався надто високим для виконання відомими рослинними ферментами.
Механізм: приховане активувальне глюкозилювання
Команда Йоркського університету виявила, що тютюнова рослина долає цей хімічний бар’єр за допомогою неочікуваного проміжного компонента — глюкози. Рослина тимчасово приєднує молекулу цукру глюкози до нікотинової кислоти, дестабілізуючи сполуку та знижуючи енергію активації, необхідну для подальших ферментативних реакцій.
Ця біологічна стратегія, названа прихованим активувальним глюкозилюванням, діє як тимчасова молекулярна мітка. Щойно глюкоза активує прекурсор, інші ферменти з’єднують кільце з N-метилпіролінієм. Відразу після утворення структурного зв’язку інший фермент відщеплює цукор від комплексу, залишаючи готову молекулу нікотину.
Оскільки молекула глюкози від’єднується до того, як кінцевий продукт виходить із ферментативного комплексу, вона не залишає хімічного сліду в готовому алкалоїді. Цей тимчасовий характер пояснює, чому покоління аналітичних хіміків не могли ізолювати проміжні стадії цього шляху.
«Загадка того, як тютюнові рослини виробляють нікотин, існує ще з кінця 1820-х років, коли нікотин уперше виділили з цих рослин», — сказав Ліхман. «Завдяки цим новим знанням ми можемо видаляти або перепрофільовувати нікотин, який природно виробляє рослина, і створювати кращі біотехнологічні інструменти. Також існує захопливий потенціал для майбутньої адаптації системи утворення нікотину в тютюні для виробництва корисних фармацевтичних сполук».
Каскад із чотирьох ферментів
Щоб підтвердити послідовність реакцій, дослідницька група ізолювала та очистила чотири різні ферменти з тканин тютюну, відтворивши весь метаболічний шлях поза живою клітиною.
| Фермент | Біохімічна функція | Роль у шляху |
|---|---|---|
| NaGT | Глюкозилтрансфераза | Приєднує глюкозу до нікотинової кислоти для створення активованого проміжного продукту. |
| NaGR | Редуктаза | Переносить атоми водню для відновлення активованої молекули прекурсора. |
| NicGS | Синтаза сполучення | Забезпечує стереохімічний контроль, утворюючи біологічно активний (S)-нікотин. |
| NicGH | Глюкозидаза / гідролаза | Гідролізує та видаляє тимчасову глюкозну мітку, утворюючи чистий нікотин. |
Використовуючи рентгенівську кристалографію високої роздільної здатності, перший автор Бенджамін Швабе визначив тривимірні структури NaGR і NicGS з атомною роздільною здатністю. Структурні моделі показали, що NicGS фізично орієнтує проміжні продукти реакції у своїй зв’язувальній кишені, спрямовуючи просторову конфігурацію кінцевого зв’язку.
Цей структурний контроль є біологічно вирішальним. Біологічні молекули часто існують як хіральні енантіомери — дзеркальні версії однієї хімічної формули. Тютюнові рослини виробляють майже виключно (S)-нікотин — оптичний ізомер, який ефективно зв’язується з неврологічними рецепторами ссавців. Коли дослідники тестували шлях без NicGS, система утворювала неконтрольовану рацемічну суміш ліво- та правообертальних ізомерів, доводячи, що NicGS визначає стереохімічну точність природного тютюну.
Перевірка в живих рослинних системах
Після безклітинного лабораторного синтезу дослідники підтвердили ферментативний шлях у живій рослинній тканині. Вони ввели гени, що кодують чотири ферменти, у Nicotiana benthamiana — дикого австралійського родича тютюну, який широко використовується в сільськогосподарських і фармацевтичних дослідженнях.
Модифіковані рослини виробляли мічені молекули нікотину, що відповідали природним рослинним профілям. Крім того, вимикаючи окремі гени в каскаді, дослідники підтвердили кожен етап:
- Пригнічення NicGH призводило до накопичення рослинами стабільних прекурсорів нікотину, зв’язаних із глюкозою, без утворення вільного нікотину.
- Виключення NicGS порушувало стереоспецифічність шляху, підтверджуючи його регуляторну роль у живому клітинному середовищі.
Удосконалення тютюнових платформ для молекулярного фермерства
Ідентифікація цих чотирьох ферментів має безпосередню цінність для сучасного біовиробництва. Хоча комерційний тютюн асоціюється насамперед із сигаретами, біологи рослин часто використовують види тютюну для молекулярного фермерства — застосовуючи швидкозростаючі рослинні тканини як біореактори для синтезу медичних білків, моноклональних антитіл і вакцинних антигенів.
Nicotiana benthamiana є пріоритетною культурою для молекулярного фермерства, оскільки за кілька тижнів вона дає великі обсяги біомаси та легко приймає вектори транзиторної експресії. Однак природне виробництво нікотину створює постійну проблему для виробництва. Алкалоїд токсичний для людей у фармацевтичних концентраціях і очищується разом із цільовими білками, що вимагає дорогих багатоступеневих процесів фільтрації для виділення терапевтичних молекул.
«Тютюнові рослини можуть використовуватися в біотехнологіях як платформи для виробництва вакцин або інших фармацевтичних продуктів, але цьому заважає наявність нікотину, який забруднює продукти та потребує обробки для його видалення», — пояснив Ліхман.
Використовуючи інструменти цільового редагування генів, як-от CRISPR, для деактивації генів, що кодують NaGT або NicGS, фахівці із сільськогосподарських наук можуть виводити безнікотинові лінії тютюну. Ці рослини зберігають швидкий вегетативний ріст і здатність до синтезу білків, водночас повністю усуваючи алкалоїдне забруднення та знижуючи виробничі витрати на терапевтичні препарати рослинного походження.
Створення нових фармацевтичних алкалоїдів
Відкриття також створює ферментативну основу для синтезу лікарських сполук, що не викликають залежності. Модульна природа системи з чотирьох ферментів дозволяє дослідникам подавати в каскад альтернативні молекули прекурсорів.
У випробуваннях для підтвердження концепції дослідницька група продемонструвала, що заміна аналогів прекурсорів дозволила ферментам виробляти споріднені алкалоїди, зокрема норнікотин і анабазин. Оскільки багато алкалоїдів рослинного походження слугують структурною основою для препаратів для центральної нервової системи, знеболювальних засобів та інсектицидів, адаптація цього ферментативного механізму пропонує чистий метод виробництва складних хімічних сполук без високотемпературного промислового синтезу.
«Це відкриває нові способи використовувати тютюнові рослини на благо: не в сигаретах, а для ліків та інших цінних продуктів», — сказав Ліхман.
- Результати дослідження доступні онлайн у журналі Nature Communications.
