Biochemicy z University of York, współpracujący z międzynarodowymi partnerami, opisali pełny szlak enzymatyczny wykorzystywany przez rośliny tytoniu do syntezy nikotyny z prostych chemicznych elementów budulcowych. Odkrycie rozwiązuje biologiczną zagadkę istniejącą od czasu, gdy chemicy po raz pierwszy wyizolowali nikotynę z liści tytoniu w 1828 roku.
Wyniki wyjaśniają mechanizmy genetyczne i biochemiczne odpowiedzialne za produkcję uzależniającego alkaloidu. Poza znaczeniem dla rolniczej uprawy tytoniu badania dostarczają narzędzi molekularnych do usuwania nikotyny z gatunków tytoniu wykorzystywanych jako platformy produkcyjne dla farmaceutyków, szczepionek i białek diagnostycznych.
„To wielki moment dla nauki o roślinach i biochemii — mamy teraz odpowiedź, której poszukiwaliśmy od ponad 200 lat!” — powiedział dr Benjamin Lichman z Centre for Novel Agricultural Products na University of York.
Dwa stulecia poszukiwań szlaku biosyntezy nikotyny
W środowisku naturalnym nikotyna pełni przede wszystkim funkcję obronnego alkaloidu. Rośliny tytoniu wytwarzają ten związek w korzeniach i transportują go do liści, aby odstraszać owady roślinożerne i zwierzęta pasące się. Po spożyciu przez człowieka cząsteczka wiąże się bezpośrednio z nikotynowymi receptorami acetylocholinowymi w układzie nerwowym, działając pobudzająco i prowadząc do uzależnienia fizycznego.
Przez dziesięciolecia badacze rozumieli podstawowe prekursory chemiczne wymagane do powstania nikotyny. Analizy strukturalne potwierdziły, że cząsteczka składa się z dwóch odrębnych pierścieni heterocyklicznych połączonych pojedynczym wiązaniem węgiel–węgiel:
- Pierścień pirydynowy: Pochodzi od kwasu nikotynowego (formy witaminy B3).
- Pierścień pirolidynowy: Powstaje z pochodzącego od aminokwasu kationu N-metylopiroliniowego.
Pomimo znajomości materiałów wyjściowych naukowcy nie potrafili zidentyfikować mechanizmu katalitycznego odpowiedzialnego za połączenie obu pierścieni. Próby obserwacji bezpośredniej kondensacji tych cząsteczek w warunkach laboratoryjnych wielokrotnie kończyły się niepowodzeniem, ponieważ kwas nikotynowy pozostaje chemicznie stabilny w standardowych warunkach biologicznych. Bez etapu aktywacji bariera energetyczna połączenia pierścieni była zbyt wysoka, aby znane enzymy roślinne mogły przeprowadzić tę reakcję.
Mechanizm: ukryta aktywująca glukozylacja
Zespół z University of York odkrył, że roślina tytoniu omija tę barierę chemiczną, wykorzystując nieoczekiwany związek pośredni: glukozę. Roślina tymczasowo przyłącza cząsteczkę cukru glukozowego do kwasu nikotynowego, destabilizując związek i obniżając energię aktywacji wymaganą w kolejnych reakcjach enzymatycznych.
Ta strategia biologiczna, określana jako ukryta aktywująca glukozylacja, działa jak tymczasowy uchwyt molekularny. Gdy glukoza aktywuje prekursor, inne enzymy łączą pierścień z N-metylopirolinią. Natychmiast po utworzeniu wiązania strukturalnego kolejny enzym odcina cukier od kompleksu, pozostawiając gotową cząsteczkę nikotyny.
Ponieważ cząsteczka glukozy odłącza się, zanim końcowy produkt opuści kompleks enzymatyczny, nie pozostawia chemicznego śladu w gotowym alkaloidzie. Ten przejściowy charakter wyjaśnia, dlaczego pokolenia chemików analitycznych nie zdołały wyizolować pośrednich etapów tego szlaku.
„Zagadka dotycząca tego, jak rośliny tytoniu produkują nikotynę, istnieje od końca lat 20. XIX wieku, kiedy nikotynę po raz pierwszy wyizolowano z tych roślin” — powiedział Lichman. „Dzięki tej nowej wiedzy możemy usuwać lub wykorzystywać w inny sposób nikotynę naturalnie produkowaną przez roślinę oraz tworzyć lepsze narzędzia biotechnologiczne. Istnieje również ekscytujący potencjał na przyszłość, aby dostosować system tworzenia nikotyny w tytoniu do produkcji użytecznych związków farmaceutycznych.”
Kaskada czterech enzymów
Aby zweryfikować sekwencję reakcji, zespół badawczy wyizolował i oczyścił cztery odrębne enzymy z tkanek tytoniu, odtwarzając cały szlak metaboliczny poza żywą komórką.
| Enzym | Funkcja biochemiczna | Rola w szlaku |
|---|---|---|
| NaGT | Glukozylotransferaza | Przyłącza glukozę do kwasu nikotynowego, tworząc aktywowany związek pośredni. |
| NaGR | Reduktaza | Przenosi atomy wodoru, aby zredukować aktywowaną cząsteczkę prekursora. |
| NicGS | Synthaza sprzęgająca | Zapewnia kontrolę stereochemiczną, wytwarzając biologicznie aktywną (S)-nikotynę. |
| NicGH | Glukozydaza / hydrolaza | Hydrolizuje i usuwa tymczasowy znacznik glukozowy, dając czystą nikotynę. |
Dzięki wysokorozdzielczej krystalografii rentgenowskiej pierwszy autor, Benjamin Schwabe, określił trójwymiarowe struktury NaGR i NicGS w rozdzielczości atomowej. Modele strukturalne ujawniły, że NicGS fizycznie ukierunkowuje związki pośrednie reakcji w swojej kieszeni wiążącej, aby kontrolować przestrzenną konfigurację końcowego wiązania.
Ta kontrola strukturalna ma kluczowe znaczenie biologiczne. Cząsteczki biologiczne często występują jako enancjomery chiralne — lustrzane wersje o tym samym wzorze chemicznym. Rośliny tytoniu wytwarzają niemal wyłącznie (S)-nikotynę, izomer optyczny skutecznie wiążący się z neurologicznymi receptorami ssaków. Gdy badacze testowali szlak bez NicGS, system wytwarzał niekontrolowaną mieszaninę racemiczną izomerów lewo- i prawoskrętnych, dowodząc, że NicGS determinuje stereochemiczną precyzję naturalnego tytoniu.
Weryfikacja w żywych systemach roślinnych
Po syntezie laboratoryjnej bez udziału komórek badacze potwierdzili szlak enzymatyczny w żywej tkance roślinnej. Wprowadzili geny kodujące cztery enzymy do Nicotiana benthamiana, dzikiego australijskiego krewnego tytoniu, szeroko wykorzystywanego w badaniach rolniczych i farmaceutycznych.
Zmodyfikowane rośliny wytwarzały znakowane cząsteczki nikotyny odpowiadające naturalnym profilom roślinnym. Ponadto, wyłączając poszczególne geny w obrębie kaskady, badacze zweryfikowali każdy etap:
- Wyciszenie NicGH powodowało, że rośliny gromadziły stabilne prekursory nikotyny związane z glukozą, bez produkcji wolnej nikotyny.
- Pomijanie NicGS zakłócało stereospecyficzność szlaku, potwierdzając jego rolę regulacyjną w żywych środowiskach komórkowych.
Udoskonalanie platform tytoniowych dla rolnictwa molekularnego
Identyfikacja tych czterech enzymów ma bezpośrednie zastosowanie w nowoczesnej bioprodukcji. Chociaż komercyjny tytoń wciąż kojarzy się z papierosami, biolodzy roślin często wykorzystują gatunki tytoniu do rolnictwa molekularnego — stosując szybko rosnące tkanki roślinne jako bioreaktory do syntezy białek medycznych, przeciwciał monoklonalnych i antygenów szczepionkowych.
Nicotiana benthamiana jest preferowana w rolnictwie molekularnym, ponieważ w ciągu kilku tygodni daje dużą ilość biomasy i łatwo przyjmuje wektory ekspresji przejściowej. Jednak naturalna produkcja nikotyny stanowi stałą przeszkodę produkcyjną. Alkaloid jest toksyczny dla ludzi w stężeniach farmaceutycznych i współoczyszcza się z białkami docelowymi, co wymaga kosztownych, wieloetapowych procesów filtracji w celu wyizolowania cząsteczek terapeutycznych.
„Rośliny tytoniu mogą być wykorzystywane w biotechnologii jako platformy do produkcji szczepionek lub innych produktów farmaceutycznych, ale problem stanowi obecność nikotyny, która zanieczyszcza produkty i wymaga przetwarzania w celu jej usunięcia” — wyjaśnił Lichman.
Wykorzystując ukierunkowane narzędzia edycji genów, takie jak CRISPR, do dezaktywacji genów kodujących NaGT lub NicGS, naukowcy zajmujący się rolnictwem mogą hodować nienikotynowe linie tytoniu. Rośliny te zachowują szybki wzrost wegetatywny i zdolność syntezy białek, jednocześnie całkowicie eliminując zanieczyszczenie alkaloidami, co obniża koszty produkcji leków pochodzenia roślinnego.
Projektowanie nowych alkaloidów farmaceutycznych
Odkrycie ustanawia również ramy enzymatyczne do syntezy nieuzależniających związków leczniczych. Modułowy charakter systemu czterech enzymów pozwala badaczom wprowadzać do kaskady alternatywne cząsteczki prekursorowe.
W badaniach potwierdzających koncepcję zespół badawczy wykazał, że zastąpienie analogami prekursorów umożliwiło enzymom wytworzenie pokrewnych alkaloidów, w tym nornikotyny i anabazyny. Ponieważ wiele alkaloidów pochodzenia roślinnego stanowi strukturalny szkielet leków działających na ośrodkowy układ nerwowy, terapii przeciwbólowych i insektycydów, dostosowanie tego mechanizmu enzymatycznego oferuje czystą metodę wytwarzania złożonych związków chemicznych bez przemysłowej syntezy wysokotemperaturowej.
„Otwiera to nowe sposoby wykorzystania roślin tytoniu dla dobra: nie w papierosach, lecz do produkcji leków i innych wartościowych produktów” — powiedział Lichman.
- Wyniki badań są dostępne online w czasopiśmie Nature Communications.
