Biokemikere ved University of York har i samarbejde med internationale partnere fuldført kortlægningen af den enzymatiske vej, tobaksplanter bruger til at danne nikotin fra simple kemiske byggesten. Opdagelsen løser et biologisk puslespil, der har bestået, siden kemikere første gang udvandt nikotin fra tobaksblade i 1828.
Resultaterne tydeliggør de genetiske og biokemiske mekanismer, der er ansvarlige for produktionen af det vanedannende alkaloid. Ud over betydningen for landbrugsdyrkning af tobak giver forskningen molekylære værktøjer til at fjerne nikotin fra tobaksarter, der anvendes som produktionsplatforme for lægemidler, vacciner og diagnostiske proteiner.
“Det er et stort øjeblik inden for plantevidenskab og biokemi, at vi nu har svaret, som vi har jagtet i mere end 200 år!” sagde dr. Benjamin Lichman fra Centre for Novel Agricultural Products ved University of York.
Den to århundreder lange søgen efter nikotinbiosyntese
Nikotin fungerer primært som en alkaloidbaseret forsvarsmekanisme i naturen. Tobaksplanter producerer stoffet i deres rødder og transporterer det til bladene for at afskrække planteædende insekter og græssende dyr. Når molekylet indtages af mennesker, binder det sig direkte til nikotinerge acetylkolinreceptorer i nervesystemet, hvor det virker stimulerende og skaber fysisk afhængighed.
I årtier forstod forskere de grundlæggende kemiske forstadier, der kræves for dannelsen af nikotin. Strukturanalyser bekræftede, at molekylet består af to forskellige heterocykliske ringe, der er forbundet med en enkelt kulstof-kulstof-binding:
- En pyridinring: Afledt af nikotinsyre (en form for vitamin B3).
- En pyrrolidinring: Dannet af den aminosyreafledte kation N-methylpyrrolinium.
På trods af kendskabet til udgangsmaterialerne kunne forskerne ikke identificere det katalytiske apparat, der er ansvarligt for at binde de to ringe sammen. Forsøg på at observere den direkte kondensation af disse molekyler i laboratoriemiljøer gik gentagne gange i stå, fordi nikotinsyre forbliver kemisk stabil under standardmæssige biologiske forhold. Uden et aktiveringstrin forblev energibarrieren for at binde ringene for høj til, at kendte planteenzymer kunne udføre processen.
Mekanismen: skjult aktiverende glukosylering
Holdet fra University of York opdagede, at tobaksplanten omgår denne kemiske barriere ved at anvende et uventet mellemprodukt: glukose. Planten binder midlertidigt et glukosesukkermolekyle til nikotinsyre, hvilket destabiliserer forbindelsen og sænker den aktiveringsenergi, der kræves for efterfølgende enzymatiske reaktioner.
Denne biologiske strategi, kaldet skjult aktiverende glukosylering, fungerer som et midlertidigt molekylært håndtag. Når glukosen har aktiveret forstadiet, kobler andre enzymer ringen til N-methylpyrrolinium. Så snart den strukturelle binding er dannet, spalter et andet enzym sukkeret fra komplekset og efterlader et færdigt nikotinmolekyle.
Da glukosemolekylet frigøres, før slutproduktet forlader det enzymatiske kompleks, efterlod det ingen kemiske spor i det færdige alkaloid. Denne forbigående karakter forklarer, hvorfor generationer af analytiske kemikere ikke kunne isolere vejens mellemstadier.
“Gåden om, hvordan tobaksplanter producerer nikotin, har imidlertid eksisteret siden slutningen af 1820’erne, hvor nikotin første gang blev udvundet fra planterne,” sagde Lichman. “Med denne nye viden kan vi fjerne eller genanvende det nikotin, som planten producerer naturligt, og skabe bedre bioteknologiske værktøjer. Der er også et spændende potentiale for fremover at tilpasse tobakkens nikotindannende system til at fremstille nyttige farmaceutiske forbindelser.”
Kaskaden med fire enzymer
For at verificere reaktionssekvensen isolerede og rensede forskerholdet fire forskellige enzymer fra tobaksvæv og rekonstituerede hele den metaboliske vej uden for den levende celle.
| Enzym | Biokemisk funktion | Rolle i biosyntesevejen |
|---|---|---|
| NaGT | Glukosyltransferase | Binder glukose til nikotinsyre for at skabe et aktiveret mellemprodukt. |
| NaGR | Reduktase | Overfører hydrogenatomer for at reducere det aktiverede forstadiumsmolekyle. |
| NicGS | Koblingssyntase | Sikrer stereokemisk kontrol og producerer biologisk aktivt (S)-nikotin. |
| NicGH | Glukosidase / hydrolase | Hydrolyserer og fjerner det midlertidige glukosemærke, hvilket giver rent nikotin. |
Ved hjælp af røntgenkrystallografi med høj opløsning fastlagde førsteforfatter Benjamin Schwabe de tredimensionelle strukturer af NaGR og NicGS med atomar opløsning. De strukturelle modeller viste, at NicGS fysisk orienterer reaktionsmellemprodukterne i sin bindingslomme for at styre den rumlige konfiguration af den endelige binding.
Denne strukturelle kontrol er biologisk afgørende. Biologiske molekyler findes ofte som chirale enantiomerer – spejlbilledeudgaver af den samme kemiske formel. Tobaksplanter producerer næsten udelukkende (S)-nikotin, den optiske isomer, der binder effektivt til neurologiske receptorer hos pattedyr. Da forskerne testede biosyntesevejen uden NicGS, producerede systemet en ukontrolleret racemisk blanding af både venstre- og højredrejende isomerer, hvilket beviser, at NicGS bestemmer den stereokemiske præcision i naturlig tobak.
Verifikation i levende plantesystemer
Efter den cellefrie laboratoriesyntese validerede forskerne den enzymatiske vej i levende plantevæv. De indførte generne, der koder for de fire enzymer, i Nicotiana benthamiana, en vild australsk tobaksbeslægtet plante, der anvendes bredt i landbrugs- og lægemiddelforskning.
De genetisk modificerede planter producerede mærkede nikotinmolekyler, der afspejlede naturlige planteprofiler. Ved desuden at slå individuelle gener ud i kaskaden verificerede forskerne hvert trin:
- Undertrykkelse af NicGH fik planterne til at akkumulere stabile, glukosebundne nikotinforstadier uden at producere frit nikotin.
- Udeladelse af NicGS forstyrrede biosyntesevejens stereospecificitet og bekræftede dets regulerende rolle i levende cellulære miljøer.
Forbedring af tobaksplatforme til molekylær dyrkning
Identifikationen af disse fire enzymer har direkte anvendelse i moderne biofremstilling. Selvom kommerciel tobak fortsat er synonym med cigaretter, bruger plantebiologer ofte tobaksarter til molekylær dyrkning – hvor hurtigtvoksende plantevæv anvendes som bioreaktorer til at syntetisere medicinske proteiner, monoklonale antistoffer og vaccineantigener.
Nicotiana benthamiana foretrækkes i molekylær dyrkning, fordi den producerer store mængder biomasse inden for få uger og let accepterer vektorer til transient ekspression. Den naturlige nikotinproduktion udgør dog en vedvarende produktionsudfordring. Alkaloidet er giftigt for mennesker ved farmaceutiske koncentrationer og co-renses med målproteiner, hvilket kræver dyre filtreringsprocesser i flere trin for at isolere terapeutiske molekyler.
“Tobaksplanter kan bruges i bioteknologi som platforme til fremstilling af vacciner eller andre farmaceutiske produkter, men anvendelsen vanskeliggøres af tilstedeværelsen af nikotin, som kontaminerer produkterne og kræver behandling for at blive fjernet,” forklarede Lichman.
Ved hjælp af målrettede genredigeringsværktøjer som CRISPR til at deaktivere de gener, der koder for NaGT eller NicGS, kan landbrugsforskere forædle nikotinfrie tobakslinjer. Disse planter bevarer deres hurtige vegetative vækst og kapacitet til proteinsyntese, samtidig med at alkaloidkontaminering helt undgås, hvilket reducerer produktionsomkostningerne for planteafledte lægemidler.
Udvikling af nye farmaceutiske alkaloider
Opdagelsen etablerer også en enzymatisk ramme for syntese af ikke-vanedannende medicinske forbindelser. Den modulære karakter af systemet med fire enzymer giver forskere mulighed for at tilføre alternative forstadier til kaskaden.
I proof-of-concept-forsøg demonstrerede forskerholdet, at udskiftning med analoge forstadier gjorde enzymerne i stand til at producere beslægtede alkaloider, herunder nornikotin og anabasin. Da mange planteafledte alkaloider fungerer som strukturelle grundelementer i lægemidler til centralnervesystemet, smertebehandlinger og insektmidler, tilbyder tilpasning af denne enzymatiske mekanisme en ren metode til at producere komplekse kemiske forbindelser uden industriel syntese ved høje temperaturer.
“Det åbner nye måder at bruge tobaksplanter til gavn: ikke i cigaretter, men til lægemidler og andre værdifulde produkter,” sagde Lichman.
- Forskningsresultaterne er tilgængelige online i tidsskriftet Nature Communications.
