Yorkin yliopiston biokemistit ovat kansainvälisten yhteistyökumppaneiden kanssa selvittäneet entsymaattisen reitin, jota tupakkakasvit käyttävät nikotiinin kokoamiseen yksinkertaisista kemiallisista rakennuspalikoista. Löytö ratkaisee biologisen arvoituksen, joka on säilynyt siitä lähtien, kun kemistit eristivät nikotiinin ensimmäisen kerran tupakan lehdistä vuonna 1828.
Tulokset selventävät riippuvuutta aiheuttavan alkaloidin tuotannosta vastaavia geneettisiä ja biokemiallisia mekanismeja. Tupakan maatalousviljelyyn kohdistuvien vaikutusten lisäksi tutkimus tarjoaa molekyylitason työkaluja nikotiinin poistamiseen tupakkalajeista, joita käytetään lääkkeiden, rokotteiden ja diagnostisten proteiinien tuotantoalustoina.
”On merkittävä hetki kasvibiologiassa ja biokemiassa, että meillä on nyt vastaus kysymykseen, jota olemme tavoitelleet yli 200 vuoden ajan!” sanoi tohtori Benjamin Lichman Yorkin yliopiston uusien maataloustuotteiden keskuksesta.
Kahden vuosisadan etsintä nikotiinin biosynteesille
Nikotiini toimii luonnossa ensisijaisesti alkaloidipohjaisena puolustusmekanismina. Tupakkakasvit tuottavat yhdistettä juurissaan ja kuljettavat sen lehtiinsä karkottaakseen kasvinsyöjähyönteisiä ja laiduntavia eläimiä. Ihmisen nauttimana molekyyli sitoutuu suoraan hermoston nikotiinisiin asetyylikoliinireseptoreihin, toimii stimulanttina ja aiheuttaa fyysistä riippuvuutta.
Tutkijat ovat vuosikymmenten ajan tunteneet nikotiinin muodostumiseen tarvittavat kemialliset perusesiasteet. Rakenneanalyysit vahvistivat, että molekyyli koostuu kahdesta erillisestä heterosyklisestä renkaasta, joita yhdistää yksi hiili-hiilisidos:
- Pyridiinirengas: Johdettu nikotiinihaposta (eräs B3-vitamiinin muoto).
- Pyrrolidiinirengas: Muodostuu aminohaposta peräisin olevasta N-metyylipyrroliniumkationista.
Vaikka lähtöaineet tunnettiin, tutkijat eivät kyenneet tunnistamaan katalyyttista koneistoa, joka vastaa kahden renkaan sitomisesta toisiinsa. Yritykset havainnoida näiden molekyylien suoraa kondensaatiota laboratorio-olosuhteissa kariutuivat toistuvasti, koska nikotiinihappo pysyy kemiallisesti stabiilina tavanomaisissa biologisissa olosuhteissa. Ilman aktivointivaihetta renkaiden sitomiseen vaadittava energiakynnys pysyi liian korkeana tunnettujen kasviensyymien toteutettavaksi.
Mekanismi: piilevä aktivoiva glukosylaatio
Yorkin yliopiston tutkimusryhmä havaitsi, että tupakkakasvi ohittaa tämän kemiallisen esteen hyödyntämällä odottamatonta välituotetta: glukoosia. Kasvi sitoo tilapäisesti glukoosisokerimolekyylin nikotiinihappoon, mikä epävakauttaa yhdistettä ja alentaa seuraaviin entsymaattisiin reaktioihin tarvittavaa aktivointienergiaa.
Tämä biologinen strategia, jota kutsutaan piileväksi aktivoivaksi glukosylaatioksi, toimii tilapäisenä molekyylikahvana. Kun glukoosi on aktivoinut esiasteen, muut entsyymit yhdistävät renkaan N-metyylipyrroliniumiin. Heti kun rakenteellinen sidos muodostuu, toinen entsyymi pilkkoo sokerin irti kompleksista, jolloin jäljelle jää valmis nikotiinimolekyyli.
Koska glukoosimolekyyli irtoaa ennen kuin lopputuote poistuu entsymaattisesta ryhmästä, se ei jätä kemiallista jälkeä valmiiseen alkaloidiin. Tämä ohimenevä luonne selittää, miksi useat analyyttisten kemistien sukupolvet eivät onnistuneet eristämään reitin välivaiheita.
”Arvoitus siitä, miten tupakkakasvit tuottavat nikotiinia, on kuitenkin ollut olemassa 1820-luvun lopulta lähtien, jolloin nikotiini eristettiin kasveista ensimmäisen kerran”, Lichman sanoi. ”Tämän uuden tiedon avulla voimme poistaa tai uudelleenkäyttää kasvin luonnollisesti tuottamaa nikotiinia ja luoda parempia bioteknologisia työkaluja. Lisäksi tulevaisuudessa on jännittäviä mahdollisuuksia soveltaa tupakan nikotiinia muodostavaa järjestelmää hyödyllisten farmaseuttisten yhdisteiden valmistukseen.”
Neljän entsyymin kaskadi
Vahvistaakseen reaktiosekvenssin tutkimusryhmä eristi ja puhdisti tupakkakudoksista neljä erillistä entsyymiä ja rekonstituoi koko aineenvaihduntareitin elävän solun ulkopuolella.
| Entsyymi | Biokemiallinen toiminto | Rooli reitissä |
|---|---|---|
| NaGT | Glukosyylitransferaasi | Liittää glukoosin nikotiinihappoon muodostaen aktivoidun välituotteen. |
| NaGR | Reduktaasi | Siirtää vetyatomeja aktivoidun esiasteen molekyylin pelkistämiseksi. |
| NicGS | Kytkentäsyntaasi | Varmistaa stereokemiallisen kontrollin tuottaen biologisesti aktiivista (S)-nikotiinia. |
| NicGH | Glukosidaasi / hydrolaasi | Hydrolysoi ja poistaa väliaikaisen glukoosimerkinnän, jolloin tuloksena on puhdasta nikotiinia. |
Korkean erotuskyvyn röntgenkristallografian avulla ensimmäinen kirjoittaja Benjamin Schwabe määritti NaGR:n ja NicGS:n kolmiulotteiset rakenteet atomitarkkuudella. Rakenneanalyysit osoittivat, että NicGS asemoi reaktion välituotteet fyysisesti sitoutumistaskussaan ohjatakseen lopullisen sidoksen avaruudellista konfiguraatiota.
Tämä rakenteellinen kontrolli on biologisesti ratkaisevaa. Biologiset molekyylit esiintyvät usein kiraalisina enantiomeereina – saman kemiallisen kaavan peilikuvaversioina. Tupakkakasvit tuottavat lähes yksinomaan (S)-nikotiinia, optista isomeeria, joka sitoutuu tehokkaasti nisäkkäiden neurologisiin reseptoreihin. Kun tutkijat testasivat reittiä ilman NicGS:ää, järjestelmä tuotti hallitsemattoman raseemisen seoksen sekä vasen- että oikeakätisiä isomeereja. Tämä osoitti, että NicGS määrittää luonnollisen tupakan stereokemiallisen tarkkuuden.
Vahvistus elävissä kasvijärjestelmissä
Soluttoman laboratoriosynteesin jälkeen tutkijat validoivat entsymaattisen reitin elävässä kasvikudoksessa. He siirsivät neljää entsyymiä koodaavat geenit Nicotiana benthamiana -kasviin, joka on villi australialainen tupakan sukulaislaji ja jota hyödynnetään laajalti maatalous- ja farmaseuttisessa tutkimuksessa.
Muokatut kasvit tuottivat leimattuja nikotiinimolekyylejä, jotka vastasivat luonnollisten kasvien profiileja. Lisäksi tutkijat vahvistivat jokaisen vaiheen poistamalla yksittäisiä geenejä kaskadista:
- NicGH:n vaimentaminen sai kasvit keräämään stabiileja, glukoosiin sitoutuneita nikotiinin esiasteita ilman vapaan nikotiinin tuotantoa.
- NicGS:n poisjättäminen häiritsi reitin stereospesifisyyttä ja vahvisti sen säätelyroolin elävissä soluympäristöissä.
Tupakan tuotantoalustojen parantaminen molekyyliviljelyä varten
Näiden neljän entsyymin tunnistamisella on suoraa hyötyä nykyaikaisessa biotuotannossa. Vaikka kaupallinen tupakka yhdistetään edelleen savukkeisiin, kasvibiologit käyttävät usein tupakkalajeja molekyyliviljelyyn – nopeasti kasvavia kasvikudoksia hyödynnetään bioreaktoreina lääketieteellisten proteiinien, monoklonaalisten vasta-aineiden ja rokoteantigeenien synteesiin.
Nicotiana benthamiana on suosittu molekyyliviljelyssä, koska se tuottaa suuria määriä biomassaa muutamassa viikossa ja vastaanottaa helposti ohimenevän ilmentymisen vektoreita. Luontainen nikotiinituotanto aiheuttaa kuitenkin jatkuvan haasteen valmistukselle. Alkaloidi on ihmiselle myrkyllinen farmaseuttisissa pitoisuuksissa ja yhteispuhdistuu kohdeproteiinien kanssa, mikä edellyttää kalliita, monivaiheisia suodatusprosesseja terapeuttisten molekyylien eristämiseksi.
”Tupakkakasveja voidaan käyttää bioteknologiassa alustoina rokotteiden tai muiden farmaseuttisten tuotteiden valmistukseen, mutta nikotiinin läsnäolo vaikeuttaa tätä, sillä se kontaminoi tuotteet ja edellyttää käsittelyä sen poistamiseksi”, Lichman selitti.
Käyttämällä kohdennettuja geeninmuokkaustyökaluja, kuten CRISPR:ää, NaGT:tä tai NicGS:ää koodaavien geenien inaktivointiin maataloustutkijat voivat jalostaa nikotiinittomia tupakkalinjoja. Nämä kasvit säilyttävät nopean vegetatiivisen kasvunsa ja proteiinisynteesikapasiteettinsa, mutta välttävät täysin alkaloidikontaminaation, mikä alentaa kasviperäisten terapeuttisten tuotteiden valmistuskustannuksia.
Uusien farmaseuttisten alkaloidien suunnittelu
Löytö luo myös entsymaattisen perustan riippuvuutta aiheuttamattomien lääkinnällisten yhdisteiden synteesille. Neljän entsyymin järjestelmän modulaarinen luonne mahdollistaa vaihtoehtoisten esiasteen molekyylien syöttämisen kaskadiin.
Konseptin toimivuuden osoittavissa kokeissa tutkimusryhmä osoitti, että esiasteanalogien korvaaminen mahdollisti entsyymien tuottaa sukulaisalkaloideja, kuten nornikotiinia ja anabasiinia. Koska monet kasviperäiset alkaloidit toimivat keskushermostolääkkeiden, kivunhoitojen ja hyönteismyrkkyjen rakennerunkoina, tämän entsymaattisen mekanismin soveltaminen tarjoaa puhtaan menetelmän monimutkaisten kemiallisten yhdisteiden tuottamiseen ilman korkean lämpötilan teollista synteesiä.
”Se avaa uusia tapoja käyttää tupakkakasveja hyvään: ei savukkeissa, vaan lääkkeissä ja muissa arvokkaissa tuotteissa”, Lichman sanoi.
- Tutkimustulokset ovat saatavilla verkossa Nature Communications -lehdessä.
