Biochemici z Univerzity v Yorku v spolupráci s medzinárodnými kolegami dokončili mapovanie enzymatickej dráhy, ktorú tabakové rastliny používajú na zostavenie nikotínu z jednoduchých chemických stavebných prvkov. Objav rieši biologickú hádanku, ktorá pretrvávala od chvíle, keď chemici v roku 1828 prvýkrát extrahovali nikotín z tabakových listov.
Zistenia objasňujú genetické a biochemické mechanizmy zodpovedné za tvorbu návykového alkaloidu. Okrem dôsledkov pre poľnohospodárske pestovanie tabaku poskytuje výskum molekulárne nástroje na odstránenie nikotínu z druhov tabaku používaných ako výrobné platformy pre liečivá, vakcíny a diagnostické proteíny.
„Je to významný okamih pre rastlinnú vedu a biochémiu, pretože teraz máme odpoveď, ktorú sme hľadali viac ako 200 rokov!“ povedal Dr. Benjamin Lichman z Centra pre nové poľnohospodárske produkty na Univerzite v Yorku.
Dvestoročné hľadanie biosyntézy nikotínu
Nikotín v prírode funguje predovšetkým ako alkaloidný obranný mechanizmus. Tabakové rastliny vytvárajú túto zlúčeninu v koreňoch a transportujú ju do listov, aby odpudzovali bylinožravý hmyz a pasúce sa zvieratá. Pri konzumácii človekom sa molekula priamo viaže na nikotínové acetylcholínové receptory v nervovom systéme, pôsobí ako stimulant a vedie k fyzickej závislosti.
Výskumníci celé desaťročia rozumeli základným chemickým prekurzorom potrebným na tvorbu nikotínu. Štrukturálne analýzy potvrdili, že molekula pozostáva z dvoch odlišných heterocyklických kruhov spojených jedinou väzbou uhlík–uhlík:
- Pyridínový kruh: Pochádza z kyseliny nikotínovej (formy vitamínu B3).
- Pyrrolidínový kruh: Vzniká z katiónu N-metylpyrrolínia odvodeného od aminokyseliny.
Napriek poznaniu východiskových látok vedci nedokázali identifikovať katalytický aparát zodpovedný za spojenie týchto dvoch kruhov. Pokusy pozorovať priamu kondenzáciu týchto molekúl v laboratórnom prostredí opakovane zlyhávali, pretože kyselina nikotínová zostáva za štandardných biologických podmienok chemicky stabilná. Bez aktivačného kroku zostávala energetická bariéra pre spojenie kruhov príliš vysoká na to, aby ju dokázali prekonať známe rastlinné enzýmy.
Mechanizmus: skrytá aktivačná glukozylácia
Tím z Univerzity v Yorku zistil, že tabaková rastlina obchádza túto chemickú bariéru použitím nečakaného medziproduktu: glukózy. Rastlina dočasne naviaže molekulu cukru glukózy na kyselinu nikotínovú, čím destabilizuje zlúčeninu a znižuje aktivačnú energiu potrebnú pre následné enzymatické reakcie.
Táto biologická stratégia, označovaná ako skrytá aktivačná glukozylácia, funguje ako dočasný molekulárny úchyt. Keď glukóza aktivuje prekurzor, ďalšie enzýmy spoja kruh s N-metylpyrrolíniom. Hneď ako sa vytvorí štrukturálna väzba, iný enzým odštiepi cukor z komplexu a zanechá hotovú molekulu nikotínu.
Keďže sa molekula glukózy odpojí predtým, než konečný produkt opustí enzymatický komplex, v hotovom alkaloide nezanecháva žiadnu chemickú stopu. Táto prechodná povaha vysvetľuje, prečo generácie analytických chemikov nedokázali izolovať medzistupne tejto dráhy.
„Hádanka, ako tabakové rastliny produkujú nikotín, existuje od konca 20. rokov 19. storočia, keď bol nikotín z rastlín prvýkrát extrahovaný,“ povedal Lichman. „Vďaka týmto novým poznatkom môžeme odstrániť alebo premeniť nikotín, ktorý rastlina prirodzene produkuje, vytvoriť lepšie biotechnologické nástroje a existuje aj vzrušujúci potenciál do budúcnosti prispôsobiť systém tvorby nikotínu v tabaku na výrobu užitočných farmaceutických zlúčenín.“
Kaskáda štyroch enzýmov
Na overenie reakčnej sekvencie výskumný tím izoloval a purifikoval štyri odlišné enzýmy z tabakových tkanív, čím rekonštituoval celú metabolickú dráhu mimo živej bunky.
| Enzým | Biochemická funkcia | Úloha v dráhe |
|---|---|---|
| NaGT | Glukozyltransferáza | Pripája glukózu ku kyseline nikotínovej a vytvára aktivovaný medziprodukt. |
| NaGR | Reduktáza | Prenáša atómy vodíka na redukciu aktivovanej molekuly prekurzora. |
| NicGS | Spojovacia syntáza | Zabezpečuje stereochemickú kontrolu a vytvára biologicky aktívny (S)-nikotín. |
| NicGH | Glukozidáza / hydroláza | Hydrolyzuje a odstraňuje dočasnú glukózovú značku, čím vzniká čistý nikotín. |
Pomocou röntgenovej kryštalografie s vysokým rozlíšením prvý autor Benjamin Schwabe určil trojrozmerné štruktúry NaGR a NicGS v atómovom rozlíšení. Štrukturálne modely ukázali, že NicGS fyzicky orientuje reakčné medziprodukty vo svojom väzbovom mieste tak, aby riadil priestorovú konfiguráciu výslednej väzby.
Táto štrukturálna kontrola je biologicky rozhodujúca. Biologické molekuly často existujú ako chirálne enantioméry — zrkadlovo obrazové verzie rovnakého chemického vzorca. Tabakové rastliny produkujú takmer výlučne (S)-nikotín, optický izomér, ktorý sa účinne viaže na neurologické receptory cicavcov. Keď výskumníci testovali dráhu bez NicGS, systém vytvoril nekontrolovanú racemickú zmes ľavotočivých aj pravotočivých izomérov, čo dokázalo, že NicGS určuje stereochemickú presnosť prirodzeného tabaku.
Overenie v živých rastlinných systémoch
Po bezbunkovej laboratórnej syntéze výskumníci overili enzymatickú dráhu v živom rastlinnom tkanive. Zaviedli gény kódujúce štyri enzýmy do Nicotiana benthamiana, divokého austrálskeho príbuzného tabaku, ktorý sa široko využíva v poľnohospodárskom a farmaceutickom výskume.
Geneticky upravené rastliny produkovali označené molekuly nikotínu, ktoré zodpovedali prirodzeným profilom rastlín. Okrem toho výskumníci vyradením jednotlivých génov v kaskáde overili každý krok:
- Potlačenie NicGH spôsobilo, že rastliny akumulovali stabilné prekurzory nikotínu viazané na glukózu bez tvorby voľného nikotínu.
- Vynechanie NicGS narušilo stereošpecificitu dráhy, čím potvrdilo jeho regulačnú úlohu v živom bunkovom prostredí.
Zlepšovanie tabakových platforiem pre molekulárne poľnohospodárstvo
Identifikácia týchto štyroch enzýmov má priamy význam pre modernú biovýrobu. Hoci komerčný tabak zostáva synonymom cigariet, rastlinní biológovia často využívajú druhy tabaku na molekulárne poľnohospodárstvo — používajú rýchlo rastúce rastlinné tkanivá ako bioreaktory na syntézu medicínskych proteínov, monoklonálnych protilátok a vakcinačných antigénov.
Nicotiana benthamiana sa v molekulárnom poľnohospodárstve uprednostňuje, pretože v priebehu týždňov poskytuje veľké objemy biomasy a ľahko prijíma vektory pre prechodnú expresiu. Prirodzená produkcia nikotínu však predstavuje pretrvávajúcu výrobnú prekážku. Alkaloid je pre ľudí pri farmaceutických koncentráciách toxický a kopurifikuje sa s cieľovými proteínmi, čo si vyžaduje nákladné viacstupňové filtračné procesy na izoláciu terapeutických molekúl.
„Tabakové rastliny možno v biotechnológiách používať ako platformy na výrobu vakcín alebo iných farmaceutických produktov, no problémom je prítomnosť nikotínu, ktorý produkty kontaminuje a vyžaduje spracovanie na jeho odstránenie,“ vysvetlil Lichman.
Použitím cielených nástrojov na úpravu génov, ako je CRISPR, na deaktiváciu génov kódujúcich NaGT alebo NicGS môžu poľnohospodárski vedci vyšľachtiť nenikotínové línie tabaku. Tieto rastliny si zachovávajú rýchly vegetatívny rast a kapacitu syntézy proteínov, pričom úplne eliminujú kontamináciu alkaloidmi, čo znižuje výrobné náklady rastlinne odvodených terapeutík.
Vývoj nových farmaceutických alkaloidov
Objav zároveň vytvára enzymatický rámec pre syntézu nenávykových liečivých zlúčenín. Modulárna povaha systému štyroch enzýmov umožňuje výskumníkom privádzať do kaskády alternatívne molekuly prekurzorov.
V skúškach na overenie konceptu výskumný tím preukázal, že nahradenie analógov prekurzorov umožnilo enzýmom produkovať príbuzné alkaloidy vrátane nornikotínu a anabazínu. Keďže mnohé rastlinné alkaloidy slúžia ako štruktúrne základy liekov pre centrálny nervový systém, terapií bolesti a insekticídov, prispôsobenie tohto enzymatického mechanizmu ponúka čistý spôsob výroby komplexných chemických zlúčenín bez priemyselnej syntézy pri vysokých teplotách.
„Otvára to nové možnosti využitia tabakových rastlín na dobré účely: nie v cigaretách, ale na lieky a ďalšie hodnotné produkty,“ povedal Lichman.
- Výsledky výskumu sú dostupné online v časopise Nature Communications.
