Биохимики Йоркского университета совместно с международными коллегами полностью установили ферментативный путь, который растения табака используют для синтеза никотина из простых химических строительных блоков. Это открытие решает биологическую загадку, существовавшую с тех пор, как химики впервые выделили никотин из листьев табака в 1828 году.
Полученные результаты проясняют генетические и биохимические механизмы, отвечающие за выработку вызывающего зависимость алкалоида. Помимо значения для сельскохозяйственного выращивания табака, исследование предоставляет молекулярные инструменты для удаления никотина из видов табака, используемых в качестве платформ для производства фармацевтических препаратов, вакцин и диагностических белков.
«Это важнейший момент для науки о растениях и биохимии: теперь у нас есть ответ, который мы искали более 200 лет!» — заявил доктор Бенджамин Личман из Центра новых сельскохозяйственных продуктов Йоркского университета.
Двухвековой поиск пути биосинтеза никотина
В природе никотин действует преимущественно как защитный алкалоидный механизм. Растения табака вырабатывают это соединение в корнях и транспортируют его в листья, чтобы отпугивать насекомых-фитофагов и пасущихся животных. При употреблении человеком молекула напрямую связывается с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами нервной системы, действуя как стимулятор и вызывая физическую зависимость.
На протяжении десятилетий исследователи понимали, какие основные химические предшественники необходимы для образования никотина. Структурный анализ подтвердил, что молекула состоит из двух различных гетероциклических колец, соединённых одинарной углерод-углеродной связью:
- Пиридиновое кольцо: образуется из никотиновой кислоты (одной из форм витамина B3).
- Пирролидиновое кольцо: образуется из катиона N-метилпирролиния, производного аминокислот.
Несмотря на знание исходных веществ, учёные не могли определить каталитический механизм, отвечающий за соединение двух колец. Попытки наблюдать прямую конденсацию этих молекул в лабораторных условиях неоднократно оказывались безуспешными, поскольку никотиновая кислота сохраняет химическую стабильность при стандартных биологических условиях. Без стадии активации энергетический барьер для связывания колец оставался слишком высоким для известных растительных ферментов.
Механизм: скрытая активирующая глюкозилизация
Команда Йоркского университета обнаружила, что растение табака преодолевает этот химический барьер с помощью неожиданного промежуточного компонента — глюкозы. Растение временно присоединяет молекулу сахара глюкозы к никотиновой кислоте, дестабилизируя соединение и снижая энергию активации, необходимую для последующих ферментативных реакций.
Эта биологическая стратегия, названная скрытой активирующей глюкозилизацией, действует как временная молекулярная метка. После активации предшественника глюкозой другие ферменты соединяют кольцо с N-метилпирролинием. Как только структурная связь образуется, другой фермент отщепляет сахар от комплекса, оставляя готовую молекулу никотина.
Поскольку молекула глюкозы отделяется до выхода конечного продукта из ферментативного кластера, она не оставляет химического следа в готовом алкалоиде. Этот временный характер объясняет, почему поколения аналитических химиков не могли выделить промежуточные стадии данного пути.
«Загадка того, как растения табака вырабатывают никотин, существовала с конца 1820-х годов, когда никотин впервые был извлечён из этих растений, — сказал Личман. — Благодаря этим новым знаниям мы можем удалять или перенаправлять никотин, естественным образом вырабатываемый растением, создавать более совершенные биотехнологические инструменты, а также получать захватывающие перспективы для адаптации никотин-синтезирующей системы табака к производству полезных фармацевтических соединений».
Каскад из четырёх ферментов
Чтобы подтвердить последовательность реакций, исследовательская группа выделила и очистила четыре различных фермента из тканей табака, воссоздав весь метаболический путь вне живой клетки.
| Фермент | Биохимическая функция | Роль в пути |
|---|---|---|
| NaGT | Глюкозилтрансфераза | Присоединяет глюкозу к никотиновой кислоте, образуя активированный промежуточный продукт. |
| NaGR | Редуктаза | Переносит атомы водорода для восстановления активированной молекулы-предшественника. |
| NicGS | Синтаза сопряжения | Обеспечивает стереохимический контроль, образуя биологически активный (S)-никотин. |
| NicGH | Глюкозидаза / гидролаза | Гидролизует и удаляет временную глюкозную метку, образуя чистый никотин. |
Используя рентгеновскую кристаллографию высокого разрешения, первый автор Бенджамин Швабе определил трёхмерные структуры NaGR и NicGS с атомарным разрешением. Структурные модели показали, что NicGS физически ориентирует промежуточные продукты реакции в своём связывающем кармане, направляя пространственную конфигурацию конечной связи.
Этот структурный контроль имеет решающее биологическое значение. Биологические молекулы часто существуют в виде хиральных энантиомеров — зеркальных версий одной и той же химической формулы. Растения табака почти исключительно вырабатывают (S)-никотин — оптический изомер, эффективно связывающийся с неврологическими рецепторами млекопитающих. Когда исследователи протестировали путь без NicGS, система производила неконтролируемую рацемическую смесь лево- и правовращающих изомеров, доказывая, что именно NicGS определяет стереохимическую точность природного табака.
Проверка в живых растительных системах
После бесклеточного лабораторного синтеза исследователи подтвердили ферментативный путь в живой растительной ткани. Они ввели гены, кодирующие четыре фермента, в Nicotiana benthamiana — дикорастущий австралийский родственный вид табака, широко используемый в сельскохозяйственных и фармацевтических исследованиях.
Модифицированные растения производили меченые молекулы никотина, соответствующие естественным профилям растений. Кроме того, выключая отдельные гены в каскаде, исследователи подтвердили каждый этап:
- Подавление NicGH приводило к накоплению в растениях стабильных связанных с глюкозой предшественников никотина без выработки свободного никотина.
- Исключение NicGS нарушало стереоспецифичность пути, подтверждая его регуляторную роль в живой клеточной среде.
Совершенствование табачных платформ для молекулярного фарминга
Идентификация этих четырёх ферментов имеет прямую ценность для современного биопроизводства. Хотя коммерческий табак по-прежнему ассоциируется с сигаретами, биологи растений часто используют виды табака для молекулярного фарминга — применяя быстрорастущие растительные ткани в качестве биореакторов для синтеза медицинских белков, моноклональных антител и вакцинных антигенов.
Nicotiana benthamiana предпочтительна для молекулярного фарминга, поскольку за несколько недель даёт большие объёмы биомассы и легко принимает векторы транзиентной экспрессии. Однако естественная выработка никотина создаёт постоянное производственное препятствие. Алкалоид токсичен для человека в фармацевтических концентрациях и очищается совместно с целевыми белками, что требует дорогостоящих многоступенчатых процессов фильтрации для выделения терапевтических молекул.
«Растения табака могут использоваться в биотехнологии в качестве платформ для производства вакцин или других фармацевтических продуктов, но этому препятствует присутствие никотина, который загрязняет продукты и требует обработки для его удаления», — пояснил Личман.
Используя инструменты направленного редактирования генов, такие как CRISPR, для деактивации генов, кодирующих NaGT или NicGS, сельскохозяйственные учёные могут выводить табачные линии без никотина. Эти растения сохраняют быстрый вегетативный рост и способность к синтезу белка, полностью исключая загрязнение алкалоидами и снижая производственные затраты на терапевтические препараты растительного происхождения.
Разработка новых фармацевтических алкалоидов
Это открытие также создаёт ферментативную основу для синтеза не вызывающих зависимости лекарственных соединений. Модульная природа системы из четырёх ферментов позволяет исследователям вводить в каскад альтернативные молекулы-предшественники.
В испытаниях, подтверждающих концепцию, исследовательская группа продемонстрировала, что замена аналогов предшественников позволяет ферментам производить родственные алкалоиды, включая норникотин и анабазин. Поскольку многие алкалоиды растительного происхождения служат структурной основой для препаратов для центральной нервной системы, обезболивающих средств и инсектицидов, адаптация этого ферментативного механизма предлагает чистый способ производства сложных химических соединений без высокотемпературного промышленного синтеза.
«Это открывает новые способы использовать растения табака во благо: не в сигаретах, а для лекарств и других ценных продуктов», — сказал Личман.
- Результаты исследования доступны онлайн в журнале Nature Communications.
