York Üniversitesi’ndeki biyokimyagerler, uluslararası iş birlikçileriyle birlikte, tütün bitkilerinin basit kimyasal yapı taşlarından nikotin sentezlemek için kullandığı enzimatik yolu tamamladı. Bu keşif, kimyagerlerin 1828’de tütün yapraklarından ilk kez nikotin elde etmesinden bu yana varlığını sürdüren biyolojik bir bilmecenin çözülmesini sağlıyor.
Bulgular, bağımlılık yapıcı alkaloidin üretilmesinden sorumlu genetik ve biyokimyasal mekanizmaları açıklığa kavuşturuyor. Araştırma, tarımsal tütün yetiştiriciliğine yönelik etkilerinin ötesinde, farmasötikler, aşılar ve tanısal proteinler için üretim platformu olarak kullanılan tütün türlerinden nikotinin uzaklaştırılmasına yönelik moleküler araçlar sunuyor.
York Üniversitesi Yeni Tarımsal Ürünler Merkezi’nden Dr. Benjamin Lichman, “200 yılı aşkın süredir peşinde olduğumuz yanıtı artık bulmuş olmamız, bitki bilimi ve biyokimya açısından büyük bir an!” dedi.
Nikotin Biyosentezi İçin İki Yüzyıllık Arayış
Nikotin, doğada öncelikle bir alkaloid savunma mekanizması olarak işlev görür. Tütün bitkileri bu bileşiği köklerinde üretir ve otçul böcekleri ile otlayan hayvanları caydırmak için yapraklarına taşır. İnsanlar tarafından tüketildiğinde molekül, sinir sistemindeki nikotinik asetilkolin reseptörlerine doğrudan bağlanarak uyarıcı görevi görür ve fiziksel bağımlılığı tetikler.
Araştırmacılar, onlarca yıldır nikotin oluşumu için gerekli temel kimyasal öncülleri biliyordu. Yapısal analizler, molekülün tek bir karbon-karbon bağıyla birleşen iki farklı heterosiklik halkadan oluştuğunu doğruladı:
- Bir Piridin Halkası: Nikotinik asitten (B3 vitamininin bir formu) türetilir.
- Bir Pirrolidin Halkası: Amino asit türevi katyon N-metilpirrolinyumdan oluşur.
Kaynak maddeler bilinmesine rağmen bilim insanları, iki halkanın bağlanmasından sorumlu katalitik mekanizmayı tanımlayamadı. Bu moleküllerin laboratuvar ortamlarında doğrudan yoğunlaşmasını gözlemleme girişimleri, nikotinik asit standart biyolojik koşullarda kimyasal olarak kararlı kaldığı için defalarca sonuçsuz kaldı. Bir aktivasyon aşaması olmadan, halkaları bağlamak için gereken enerji bariyeri bilinen bitki enzimlerinin aşamayacağı kadar yüksek kaldı.
Mekanizma: Gizli Aktive Edici Glikozilasyon
York Üniversitesi ekibi, tütün bitkisinin beklenmedik bir ara ürün olan glikozu kullanarak bu kimyasal engeli aştığını keşfetti. Bitki, bir glikoz şeker molekülünü geçici olarak nikotinik aside bağlayarak bileşiği kararsızlaştırır ve sonraki enzimatik reaksiyonlar için gereken aktivasyon enerjisini düşürür.
Gizli aktive edici glikozilasyon olarak adlandırılan bu biyolojik strateji, geçici bir moleküler tutamak görevi görür. Glikoz öncülü aktive ettikten sonra, diğer enzimler halkayı N-metilpirrolinyuma bağlar. Yapısal bağ oluşur oluşmaz başka bir enzim şekeri kompleksten ayırır ve geride tamamlanmış bir nikotin molekülü bırakır.
Glikoz molekülü nihai ürün enzimatik kümeden çıkmadan önce ayrıldığı için, tamamlanmış alkaloitte hiçbir kimyasal iz bırakmadı. Bu geçici yapı, analitik kimyager kuşaklarının yolun ara aşamalarını neden izole edemediğini açıklıyor.
Lichman, “Tütün bitkilerinin nikotini nasıl ürettiğine dair bilmece, nikotinin bitkilerden ilk kez elde edildiği 1820’lerin sonlarından beri sürüyordu,” dedi. “Bu yeni bilgiyle bitkinin doğal olarak ürettiği nikotini uzaklaştırabilir veya yeniden değerlendirebilir, daha iyi biyoteknoloji araçları oluşturabiliriz; ayrıca tütünün nikotin oluşturma sistemini yararlı farmasötik bileşikler üretmek üzere uyarlamak için gelecekte heyecan verici bir potansiyel de bulunuyor.”
Dört Enzimli Kaskad
Reaksiyon dizisini doğrulamak için araştırma ekibi, tütün dokularından dört farklı enzimi izole edip saflaştırdı ve canlı hücre dışında tüm metabolik yolu yeniden oluşturdu.
| Enzim | Biyokimyasal İşlev | Yoldaki Rolü |
|---|---|---|
| NaGT | Glikoziltransferaz | Aktif bir ara ürün oluşturmak için nikotinik aside glikoz bağlar. |
| NaGR | Redüktaz | Aktifleşmiş öncül molekülü indirgemek için hidrojen atomlarını aktarır. |
| NicGS | Eşleştirme Sentazı | Stereokimyasal kontrol sağlayarak biyolojik olarak aktif (S)-nikotin üretir. |
| NicGH | Glikozidaz / Hidrolaz | Geçici glikoz etiketini hidrolize eder ve uzaklaştırarak saf nikotin elde edilmesini sağlar. |
İlk yazar Benjamin Schwabe, yüksek çözünürlüklü X-ışını kristalografisi kullanarak NaGR ve NicGS’nin üç boyutlu yapılarını atomik çözünürlükte belirledi. Yapısal modeller, NicGS’nin nihai bağın uzaysal konfigürasyonunu yönlendirmek için reaksiyon ara ürünlerini bağlanma cebinde fiziksel olarak konumlandırdığını ortaya koydu.
Bu yapısal kontrol biyolojik açıdan belirleyicidir. Biyolojik moleküller genellikle kiral enantiyomerler, yani aynı kimyasal formülün ayna görüntüsü olan versiyonlar şeklinde bulunur. Tütün bitkileri, memeli nörolojik reseptörlerine etkili biçimde bağlanan optik izomer olan neredeyse yalnızca (S)-nikotin üretir. Araştırmacılar NicGS olmadan yolu test ettiğinde sistem, hem sol hem de sağ elli izomerlerden oluşan kontrolsüz rasemik bir karışım üretti; bu da NicGS’nin doğal tütünün stereokimyasal hassasiyetini belirlediğini kanıtladı.
Canlı Bitki Sistemlerinde Doğrulama
Hücresiz laboratuvar sentezinin ardından araştırmacılar, enzimatik yolu canlı bitki dokusu içinde doğruladı. Dört enzimi kodlayan genleri, tarımsal ve farmasötik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan yabani bir Avustralya tütünü akrabası olan Nicotiana benthamiana‘ya aktardılar.
Genetiği düzenlenmiş bitkiler, doğal bitki profillerini yansıtan işaretli nikotin molekülleri üretti. Ayrıca araştırmacılar, kaskad içindeki tekil genleri devre dışı bırakarak her adımı doğruladı:
- NicGH‘nin baskılanması, bitkilerin serbest nikotin üretmeden kararlı, glikoza bağlı nikotin öncüllerini biriktirmesine neden oldu.
- NicGS‘nin çıkarılması, yolun stereospesifikliğini bozarak canlı hücresel ortamlardaki düzenleyici rolünü doğruladı.
Moleküler Tarım İçin Tütün Platformlarının Geliştirilmesi
Bu dört enzimin tanımlanması, modern biyolojik üretim için doğrudan fayda sağlar. Ticari tütün sigarayla özdeşleşmiş olsa da, bitki biyologları tütün türlerini moleküler tarım için sıkça kullanır; hızlı büyüyen bitki dokularını tıbbi proteinler, monoklonal antikorlar ve aşı antijenleri sentezleyen biyoreaktörler olarak değerlendirir.
Nicotiana benthamiana, haftalar içinde yüksek miktarda biyokütle vermesi ve geçici ekspresyon vektörlerini kolayca kabul etmesi nedeniyle moleküler tarımda tercih edilir. Ancak doğal nikotin üretimi, kalıcı bir üretim engeli oluşturur. Alkaloid, farmasötik konsantrasyonlarda insanlar için toksiktir ve hedef proteinlerle birlikte saflaşır; bu nedenle terapötik moleküllerin izole edilmesi için maliyetli, çok aşamalı filtrasyon süreçleri gerekir.
Lichman, “Tütün bitkileri biyoteknolojide aşılar veya diğer farmasötik ürünlerin üretilmesi için platform olarak kullanılabilir, ancak ürünleri kontamine eden ve uzaklaştırılması için işlem gerektiren nikotin varlığı bu süreci zorlaştırır,” diye açıkladı.
Tarımsal bilim insanları, NaGT veya NicGS’yi kodlayan genleri devre dışı bırakmak için CRISPR gibi hedefli gen düzenleme araçlarını kullanarak nikotin üretmeyen tütün hatları geliştirebilir. Bu bitkiler, alkaloid kontaminasyonunu tamamen ortadan kaldırırken hızlı vejetatif büyümelerini ve protein sentez kapasitelerini korur; böylece bitki kaynaklı terapötiklerin üretim maliyetleri düşer.
Yeni Farmasötik Alkaloidlerin Tasarlanması
Keşif ayrıca bağımlılık yapmayan tıbbi bileşiklerin sentezi için enzimatik bir çerçeve oluşturuyor. Dört enzimli sistemin modüler yapısı, araştırmacıların alternatif öncül molekülleri kaskada beslemesine olanak tanır.
Kavram kanıtlama denemelerinde araştırma ekibi, öncül analoglarının ikame edilmesinin enzimlerin nornikotin ve anabazin dâhil olmak üzere ilişkili alkaloidleri üretmesini sağladığını gösterdi. Bitki kaynaklı birçok alkaloid, merkezi sinir sistemi ilaçları, ağrı tedavileri ve insektisitler için yapısal omurga görevi gördüğünden, bu enzimatik mekanizmanın uyarlanması karmaşık kimyasal bileşiklerin yüksek sıcaklıklı endüstriyel sentez olmadan üretilmesi için temiz bir yöntem sunar.
Lichman, “Bu keşif, tütün bitkilerini sigaralarda değil, ilaçlar ve diğer değerli ürünler için faydalı biçimde kullanmanın yeni yollarını açıyor,” dedi.
- Araştırma bulgularına Nature Communications dergisinden çevrimiçi olarak erişilebilir.
