Biochemiker der University of York haben in Zusammenarbeit mit internationalen Partnern den enzymatischen Weg vollständig entschlüsselt, über den Tabakpflanzen Nikotin aus einfachen chemischen Bausteinen herstellen. Die Entdeckung löst ein biologisches Rätsel, das besteht, seit Chemiker 1828 erstmals Nikotin aus Tabakblättern extrahierten.
Die Ergebnisse klären die genetischen und biochemischen Mechanismen, die für die Produktion dieses abhängig machenden Alkaloids verantwortlich sind. Über die Auswirkungen auf den landwirtschaftlichen Tabakanbau hinaus liefert die Forschung molekulare Werkzeuge, um Nikotin aus Tabakarten zu entfernen, die als Produktionsplattformen für Arzneimittel, Impfstoffe und diagnostische Proteine genutzt werden.
„Es ist ein großer Moment für die Pflanzenwissenschaft und Biochemie, dass wir nun die Antwort haben, nach der wir mehr als 200 Jahre gesucht haben!“, sagte Dr. Benjamin Lichman vom Centre for Novel Agricultural Products der University of York.
Die zweihundertjährige Suche nach der Nikotinbiosynthese
Nikotin dient in der Natur primär als alkaloidbasierter Abwehrmechanismus. Tabakpflanzen produzieren die Verbindung in ihren Wurzeln und transportieren sie in ihre Blätter, um pflanzenfressende Insekten und weidende Tiere abzuschrecken. Beim Konsum durch Menschen bindet das Molekül direkt an nikotinische Acetylcholinrezeptoren im Nervensystem, wirkt stimulierend und fördert körperliche Abhängigkeit.
Jahrzehntelang kannten Forscher die grundlegenden chemischen Vorstufen, die für die Nikotinbildung erforderlich sind. Strukturanalysen bestätigten, dass das Molekül aus zwei unterschiedlichen heterozyklischen Ringen besteht, die durch eine einzelne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung verbunden sind:
- Ein Pyridinring: Abgeleitet von Nicotinsäure (einer Form von Vitamin B3).
- Ein Pyrrolidinring: Gebildet aus dem von einer Aminosäure abgeleiteten Kation N-Methylpyrrolinium.
Obwohl die Ausgangsstoffe bekannt waren, konnten Wissenschaftler die katalytische Maschinerie nicht identifizieren, die für die Bindung der beiden Ringe verantwortlich ist. Versuche, die direkte Kondensation dieser Moleküle unter Laborbedingungen zu beobachten, scheiterten wiederholt, da Nicotinsäure unter normalen biologischen Bedingungen chemisch stabil bleibt. Ohne einen Aktivierungsschritt blieb die Energiebarriere für die Bindung der Ringe zu hoch, als dass bekannte pflanzliche Enzyme sie überwinden könnten.
Der Mechanismus: Verdeckte aktivierende Glucosylierung
Das Team der University of York entdeckte, dass die Tabakpflanze diese chemische Barriere mithilfe eines unerwarteten Zwischenprodukts überwindet: Glucose. Die Pflanze bindet vorübergehend ein Glucose-Zuckermolekül an Nicotinsäure, destabilisiert dadurch die Verbindung und senkt die für nachfolgende enzymatische Reaktionen erforderliche Aktivierungsenergie.
Diese biologische Strategie, die als verdeckte aktivierende Glucosylierung bezeichnet wird, fungiert als temporärer molekularer Ansatzpunkt. Sobald die Glucose die Vorstufe aktiviert, koppeln andere Enzyme den Ring an N-Methylpyrrolinium. Sobald die strukturelle Bindung entstanden ist, spaltet ein weiteres Enzym den Zucker vom Komplex ab und hinterlässt ein fertiges Nikotinmolekül.
Da sich das Glucosemolekül ablöst, bevor das Endprodukt den enzymatischen Komplex verlässt, hinterlässt es im fertigen Alkaloid keine chemische Spur. Diese vorübergehende Natur erklärt, warum Generationen von analytischen Chemikern die Zwischenstufen dieses Weges nicht isolieren konnten.
„Das Rätsel, wie Tabakpflanzen Nikotin produzieren, besteht seit Ende der 1820er Jahre, als Nikotin erstmals aus den Pflanzen extrahiert wurde“, sagte Lichman. „Mit diesem neuen Wissen können wir das von der Pflanze natürlich produzierte Nikotin entfernen oder anderweitig nutzen und bessere biotechnologische Werkzeuge entwickeln. Zudem besteht ein spannendes Potenzial, das nikotinbildende System des Tabaks künftig zur Herstellung nützlicher pharmazeutischer Verbindungen anzupassen.“
Die Vier-Enzym-Kaskade
Um die Reaktionssequenz zu verifizieren, isolierte und reinigte das Forschungsteam vier unterschiedliche Enzyme aus Tabakgewebe und rekonstituierte damit den gesamten Stoffwechselweg außerhalb der lebenden Zelle.
| Enzym | Biochemische Funktion | Rolle im Stoffwechselweg |
|---|---|---|
| NaGT | Glucosyltransferase | Bindet Glucose an Nicotinsäure und erzeugt ein aktiviertes Zwischenprodukt. |
| NaGR | Reduktase | Überträgt Wasserstoffatome, um das aktivierte Vorläufermolekül zu reduzieren. |
| NicGS | Kopplungssynthase | Gewährleistet die stereochemische Kontrolle und produziert biologisch aktives (S)-Nikotin. |
| NicGH | Glucosidase / Hydrolase | Hydrolysiert und entfernt die temporäre Glucosemarkierung, wodurch reines Nikotin entsteht. |
Mithilfe hochauflösender Röntgenkristallographie bestimmte Erstautor Benjamin Schwabe die dreidimensionalen Strukturen von NaGR und NicGS mit atomarer Auflösung. Die Strukturmodelle zeigten, dass NicGS die Reaktionszwischenprodukte in seiner Bindungstasche räumlich ausrichtet, um die räumliche Konfiguration der finalen Bindung zu steuern.
Diese strukturelle Kontrolle ist biologisch entscheidend. Biologische Moleküle liegen häufig als chirale Enantiomere vor – spiegelbildliche Varianten derselben chemischen Formel. Tabakpflanzen produzieren nahezu ausschließlich (S)-Nikotin, das optische Isomer, das wirksam an neurologische Rezeptoren von Säugetieren bindet. Als die Forscher den Stoffwechselweg ohne NicGS testeten, erzeugte das System ein unkontrolliertes racemisches Gemisch aus links- und rechtshändigen Isomeren. Dies beweist, dass NicGS die stereochemische Präzision von natürlichem Tabak bestimmt.
Verifizierung in lebenden Pflanzensystemen
Nach der zellfreien Laborsynthese validierten die Forscher den enzymatischen Weg in lebendem Pflanzengewebe. Sie führten die Gene, die für die vier Enzyme kodieren, in Nicotiana benthamiana ein, einen wilden australischen Tabakverwandten, der in der Agrar- und Pharmaforschung breit eingesetzt wird.
Die gentechnisch veränderten Pflanzen produzierten markierte Nikotinmoleküle, die den natürlichen Pflanzenprofilen entsprachen. Darüber hinaus verifizierten die Forscher durch das Ausschalten einzelner Gene innerhalb der Kaskade jeden Schritt:
- Die Unterdrückung von NicGH führte dazu, dass die Pflanzen stabile, an Glucose gebundene Nikotinvorstufen anreicherten, ohne freies Nikotin zu produzieren.
- Das Weglassen von NicGS beeinträchtigte die Stereospezifität des Stoffwechselwegs und bestätigte seine regulatorische Rolle in lebenden zellulären Umgebungen.
Verbesserung von Tabakplattformen für Molecular Farming
Die Identifizierung dieser vier Enzyme ist für die moderne Bioproduktion von direktem Nutzen. Während kommerzieller Tabak weiterhin vor allem mit Zigaretten assoziiert wird, verwenden Pflanzenbiologen Tabakarten häufig für Molecular Farming – dabei werden schnell wachsende Pflanzengewebe als Bioreaktoren genutzt, um medizinische Proteine, monoklonale Antikörper und Impfstoffantigene zu synthetisieren.
Nicotiana benthamiana wird im Molecular Farming bevorzugt, da sie innerhalb weniger Wochen große Mengen Biomasse liefert und transiente Expressionsvektoren leicht aufnimmt. Die natürliche Nikotinproduktion stellt jedoch eine dauerhafte Herausforderung in der Herstellung dar. Das Alkaloid ist für Menschen in pharmazeutischen Konzentrationen toxisch und wird zusammen mit den Zielproteinen gereinigt, was kostspielige mehrstufige Filtrationsprozesse zur Isolierung therapeutischer Moleküle erforderlich macht.
„Tabakpflanzen können in der Biotechnologie als Plattformen zur Herstellung von Impfstoffen oder anderen pharmazeutischen Produkten eingesetzt werden, doch das vorhandene Nikotin verunreinigt die Produkte und muss durch Verarbeitung entfernt werden“, erklärte Lichman.
Durch den Einsatz gezielter Geneditierungswerkzeuge wie CRISPR zur Deaktivierung der Gene, die für NaGT oder NicGS kodieren, können Agrarwissenschaftler nikotinfreie Tabaklinien züchten. Diese Pflanzen behalten ihr schnelles vegetatives Wachstum und ihre Proteinsynthesekapazität bei, vermeiden jedoch vollständig Alkaloidkontaminationen und senken damit die Herstellungskosten pflanzenbasierter Therapeutika.
Entwicklung neuartiger pharmazeutischer Alkaloide
Die Entdeckung schafft zudem einen enzymatischen Rahmen für die Synthese nicht abhängig machender medizinischer Verbindungen. Der modulare Charakter des Vier-Enzym-Systems ermöglicht es Forschern, alternative Vorläufermoleküle in die Kaskade einzubringen.
In Machbarkeitsstudien zeigte das Forschungsteam, dass der Austausch von Vorläuferanaloga es den Enzymen ermöglichte, verwandte Alkaloide wie Nornikotin und Anabasin herzustellen. Da viele pflanzliche Alkaloide als strukturelle Grundgerüste für Medikamente des zentralen Nervensystems, Schmerztherapien und Insektizide dienen, bietet die Anpassung dieses enzymatischen Mechanismus eine saubere Methode zur Herstellung komplexer chemischer Verbindungen ohne industrielle Hochtemperatursynthese.
„Dies eröffnet neue Möglichkeiten, Tabakpflanzen sinnvoll zu nutzen: nicht in Zigaretten, sondern für Medikamente und andere wertvolle Produkte“, sagte Lichman.
- Die Forschungsergebnisse sind online in der Fachzeitschrift Nature Communications verfügbar.
